Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα της κυτταρικής καλλιέργειας είναι η ικανότητα χειρισμού της φυσικής χημείας της κυτταρικής αναπαραγωγής (δηλ. θερμοκρασία, pH, οσμωτική πίεση, τάση O2 και CO2) και του φυσιολογικού περιβάλλοντος (δηλ. συγκέντρωση ορμονών και θρεπτικών συστατικών).Εκτός από τη θερμοκρασία, το περιβάλλον καλλιέργειας ελέγχεται από το μέσο ανάπτυξης.
Αν και το φυσιολογικό περιβάλλον της καλλιέργειας δεν είναι τόσο σαφές όσο το φυσικό και χημικό περιβάλλον της, καλύτερη κατανόηση των συστατικών του ορού, αναγνώριση αυξητικών παραγόντων που απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό και καλύτερη κατανόηση του μικροπεριβάλλοντος των κυττάρων στην καλλιέργεια.(δηλαδή αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου, διάχυση αερίου, αλληλεπίδραση με τη μήτρα) επιτρέπει πλέον την καλλιέργεια ορισμένων κυτταρικών σειρών σε μέσα χωρίς ορό.
1. Το περιβάλλον καλλιέργειας επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων
Σημειώστε ότι οι συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας είναι διαφορετικές για κάθε τύπο κυττάρου.
Οι συνέπειες της απόκλισης από τις συνθήκες καλλιέργειας που απαιτούνται για έναν συγκεκριμένο τύπο κυττάρου κυμαίνονται από την έκφραση μη φυσιολογικών φαινοτύπων έως την πλήρη αποτυχία της κυτταρικής καλλιέργειας.Επομένως, συνιστούμε να εξοικειωθείτε με την κυτταρική σειρά που σας ενδιαφέρει και να ακολουθήσετε αυστηρά τις οδηγίες που παρέχονται για κάθε προϊόν που χρησιμοποιείτε στο πείραμά σας.
2. Προφυλάξεις για τη δημιουργία ενός βελτιστοποιημένου περιβάλλοντος κυτταροκαλλιέργειας για τα κύτταρα σας:
Μέσα καλλιέργειας και ορός (δείτε παρακάτω για περισσότερες πληροφορίες)
επίπεδα pH και CO2 (δείτε παρακάτω για περισσότερες πληροφορίες)
Καλλιεργήστε πλαστικό (δείτε παρακάτω για περισσότερες πληροφορίες)
Θερμοκρασία (δείτε παρακάτω για περισσότερες πληροφορίες)
2.1 Πολιτιστικά μέσα και ορός
Το μέσο καλλιέργειας είναι το πιο σημαντικό μέρος του περιβάλλοντος καλλιέργειας, επειδή παρέχει τα θρεπτικά συστατικά, τους αυξητικούς παράγοντες και τις ορμόνες που απαιτούνται για την ανάπτυξη των κυττάρων και ρυθμίζει το pH και την οσμωτική πίεση της καλλιέργειας.
Αν και τα αρχικά πειράματα κυτταροκαλλιέργειας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας φυσικά μέσα που προέρχονται από εκχυλίσματα ιστών και σωματικά υγρά, η ανάγκη για τυποποίηση, ποιότητα μέσων και αυξημένη ζήτηση οδήγησε στην ανάπτυξη οριστικών μέσων.Οι τρεις βασικοί τύποι μέσων είναι βασικά μέσα, μέσα μειωμένου ορού και μέσα χωρίς ορό και έχουν διαφορετικές απαιτήσεις για συμπλήρωμα ορού.
2.1.1 Βασικό μέσο
Υλικό κυτταρικής καλλιέργειας Gibco
Οι περισσότερες κυτταρικές σειρές αναπτύσσονται καλά σε βασικά μέσα που περιέχουν αμινοξέα, βιταμίνες, ανόργανα άλατα και πηγές άνθρακα (όπως γλυκόζη), αλλά αυτά τα βασικά σκευάσματα μέσων πρέπει να συμπληρώνονται με ορό.
2.1.2 Μειωμένο μέσο ορού
Μπουκάλι με Gibco Low Serum Medium
Μια άλλη στρατηγική για τη μείωση των αρνητικών επιπτώσεων του ορού σε πειράματα κυτταροκαλλιέργειας είναι η χρήση μέσων με μειωμένο ορό.Το μειωμένο μέσο ορού είναι μια φόρμουλα βασικού μέσου πλούσια σε θρεπτικά συστατικά και ζωικούς παράγοντες, που μπορεί να μειώσει την απαιτούμενη ποσότητα ορού.
2.1.3 Μέσο χωρίς ορό
Μπουκάλι με μέσο χωρίς ορό Gibco
Το μέσο χωρίς ορό (SFM) παρακάμπτει τη χρήση ζωικού ορού αντικαθιστώντας τον ορό με κατάλληλα σκευάσματα διατροφής και ορμονών.Πολλές πρωτογενείς καλλιέργειες και κυτταρικές σειρές έχουν σκευάσματα μέσου χωρίς ορό, συμπεριλαμβανομένης της γραμμής παραγωγής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ωοθηκών κινέζικου χάμστερ (CHO), διάφορες κυτταρικές σειρές υβριδώματος, σειρές εντόμων Sf9 και Sf21 (Spodoptera frugiperda), καθώς και για τον ξενιστή για παραγωγή ιού (για παράδειγμα, 293, VERO, MDCK, MDBK), κ.λπ. Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα της χρήσης ενός μέσου χωρίς ορό είναι η ικανότητα να γίνεται το μέσο επιλεκτικό για συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους επιλέγοντας έναν κατάλληλο συνδυασμό αυξητικών παραγόντων.Ο παρακάτω πίνακας παραθέτει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα των μέσων χωρίς ορό.
Πλεονέκτημα
Αυξήστε τη σαφήνεια
Πιο συνεπής απόδοση
Ευκολότερος καθαρισμός και επεξεργασία κατάντη
Αξιολογήστε με ακρίβεια τη λειτουργία των κυττάρων
Αυξήστε την παραγωγικότητα
Καλύτερος έλεγχος των φυσιολογικών αντιδράσεων
Βελτιωμένη ανίχνευση μέσων κινητής τηλεφωνίας
Μειονέκτημα
Απαιτήσεις τύπου κυψέλης για συγκεκριμένο τύπο μέσου
Χρειάζεται υψηλότερη καθαρότητα αντιδραστηρίου
Επιβράδυνση στην ανάπτυξη
2.2.1 επίπεδο pH
Οι περισσότερες φυσιολογικές κυτταρικές σειρές θηλαστικών αναπτύσσονται καλά σε pH 7,4 και οι διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών γραμμών είναι μικρές.Ωστόσο, ορισμένες μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές έχει αποδειχθεί ότι αναπτύσσονται καλύτερα σε ένα ελαφρώς όξινο περιβάλλον (pH 7,0 – 7,4), ενώ ορισμένες φυσιολογικές κυτταρικές σειρές ινοβλαστών προτιμούν ένα ελαφρώς αλκαλικό περιβάλλον (pH 7,4 – 7,7).Οι κυτταρικές σειρές εντόμων όπως Sf9 και Sf21 αναπτύσσονται καλύτερα σε pH 6,2.
2.2.2 Επίπεδο CO2
Το μέσο ανάπτυξης ελέγχει το pH της καλλιέργειας και ρυθμίζει τα κύτταρα στην καλλιέργεια για να αντισταθούν στις αλλαγές του pH.Συνήθως, αυτό το ρυθμιστικό επιτυγχάνεται περιέχοντας οργανικά (για παράδειγμα, HEPES) ή ρυθμιστικά διαλύματα με βάση το διττανθρακικό CO2.Επειδή το pH του μέσου εξαρτάται από τη λεπτή ισορροπία του διαλυμένου διοξειδίου του άνθρακα (CO2) και των διττανθρακικών (HCO3-), οι αλλαγές στο ατμοσφαιρικό CO2 θα αλλάξουν το pH του μέσου.Επομένως, όταν χρησιμοποιείται ένα μέσο ρυθμισμένο με ένα ρυθμιστικό διάλυμα με βάση το διττανθρακικό CO2, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιείται εξωγενές CO2, ειδικά όταν καλλιεργούνται κύτταρα σε ανοιχτά τρυβλία καλλιέργειας ή καλλιεργούνται μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές σε υψηλές συγκεντρώσεις.Αν και οι περισσότεροι ερευνητές χρησιμοποιούν συνήθως 5-7% CO2 στον αέρα, τα περισσότερα πειράματα κυτταροκαλλιέργειας χρησιμοποιούν συνήθως 4-10% CO2.Ωστόσο, κάθε μέσο έχει μια συνιστώμενη τάση CO2 και συγκέντρωση διττανθρακικών για την επίτευξη του σωστού pH και της οσμωτικής πίεσης.για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις οδηγίες του κατασκευαστή του μέσου.
2.3 Καλλιέργεια πλαστικών
Τα πλαστικά κυτταροκαλλιέργειας διατίθενται σε διάφορες μορφές, μεγέθη και επιφάνειες για να ταιριάζουν σε διάφορες εφαρμογές κυτταροκαλλιέργειας.Χρησιμοποιήστε τον οδηγό πλαστικής επιφάνειας κυτταροκαλλιέργειας και τον οδηγό δοχείου κυτταροκαλλιέργειας παρακάτω για να σας βοηθήσουν να επιλέξετε το κατάλληλο πλαστικό για την εφαρμογή κυτταροκαλλιέργειας.
Δείτε όλα τα πλαστικά κυτταροκαλλιέργειας Thermo Scientific Nunc (διαφημιστικός σύνδεσμος)
2.4 Θερμοκρασία
Η βέλτιστη θερμοκρασία για κυτταρική καλλιέργεια εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη θερμοκρασία του σώματος του ξενιστή από τον οποίο απομονώνονται τα κύτταρα και σε μικρότερο βαθμό από τις ανατομικές αλλαγές στη θερμοκρασία (για παράδειγμα, η θερμοκρασία του δέρματος μπορεί να είναι χαμηλότερη από αυτή των σκελετικών μυών ).Για την κυτταρική καλλιέργεια, η υπερθέρμανση είναι πιο σοβαρό πρόβλημα από την υπερθέρμανση.Επομένως, η θερμοκρασία στη θερμοκοιτίδα συνήθως ρυθμίζεται ελαφρώς κάτω από τη βέλτιστη θερμοκρασία.
2.4.1 Βέλτιστη θερμοκρασία για διάφορες κυτταρικές σειρές
Οι περισσότερες κυτταρικές σειρές ανθρώπων και θηλαστικών διατηρούνται στους 36°C έως 37°C για βέλτιστη ανάπτυξη.
Τα κύτταρα των εντόμων καλλιεργούνται στους 27°C για βέλτιστη ανάπτυξη.αναπτύσσονται πιο αργά σε χαμηλότερες θερμοκρασίες και θερμοκρασίες μεταξύ 27°C και 30°C.Πάνω από τους 30°C, η ζωτικότητα των κυττάρων των εντόμων μειώνεται, ακόμη και αν επιστρέψει στους 27°C, τα κύτταρα δεν θα ανακτήσουν.
Οι κυτταρικές σειρές πτηνών χρειάζονται 38,5°C για να φτάσουν στη μέγιστη ανάπτυξη.Αν και αυτά τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν στους 37°C, θα αναπτυχθούν πιο αργά.
Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ψυχρόαιμα ζώα (όπως αμφίβια, ψάρια ψυχρού νερού) μπορούν να ανεχθούν ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών από 15°C έως 26°C.
Ώρα δημοσίευσης: Φεβ-01-2023